動(dòng)物性產(chǎn)品中獸藥殘留的快速檢測方法
2012/4/20
[9714]
動(dòng)物性產(chǎn)品中獸藥殘留的快速檢測方法
—— ELISA & CharmⅡ
一、前言：
1、 現(xiàn)狀
目前獸醫(yī)用藥幾乎占據(jù)了所有抗微生物藥物的50%，因此食品病原菌、條件致病菌和共生菌不可避免的成了耐藥菌。在過去的50年中大約有100萬噸的抗生素被釋放到生物圈中。歐洲動(dòng)物衛(wèi)生聯(lián)盟（European Federation of Animal Health ，F(xiàn)EDESA）對歐盟和瑞士抗生素使用統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，僅1997年用于人類健康的抗生素達(dá)5460噸，用于動(dòng)物健康的抗生素達(dá)3465噸，用于動(dòng)物生長促進(jìn)劑的抗生素達(dá)1575噸，并有逐年增加的趨勢。
在我國，由于獸醫(yī)用藥制度的不完善及一些養(yǎng)殖廠受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使及相應(yīng)的檢測監(jiān)督體系不健全，藥物的濫用現(xiàn)象更為嚴(yán)重，動(dòng)物產(chǎn)品中獸藥的污染時(shí)有發(fā)生。其潛在的致癌、致畸作用引起了社會(huì)的普遍關(guān)注，由于水產(chǎn)品中氯霉素含量過高，歐盟委員會(huì)于今年1月作出禁止中國動(dòng)物源食品進(jìn)口的協(xié)議，使得我國水產(chǎn)品對歐盟出口嚴(yán)重受挫，雖然現(xiàn)在部分產(chǎn)品開始解禁，但形式依然不容樂觀；美國、日本等國也開始高度關(guān)注我國水產(chǎn)品的質(zhì)量，并出臺(tái)一系列相關(guān)政策，對我國出口動(dòng)物性產(chǎn)品進(jìn)行限制。在現(xiàn)代文明的世界，健康*的貿(mào)易法則將是關(guān)稅、價(jià)格、質(zhì)量所不可比擬的，政治上的友好往來無法替代經(jīng)濟(jì)貿(mào)易中的游戲規(guī)則。
2、食品中獸藥殘留對人類的危害
2.1耐藥菌株的產(chǎn)生
抗生素使用和細(xì)菌耐藥性永遠(yuǎn)是互相依存、互相制約的矛盾的兩個(gè)方面，細(xì)菌耐藥非正常增加，往往是抗生素的非正常使用的結(jié)果。早在1920-30年青霉素問世時(shí)，Dr Fleming就提出了青霉素的耐藥性問題。隨著時(shí)代的發(fā)展和各種新藥的出現(xiàn)，耐藥性菌株也接踵而至（即包括藥物選擇壓力的結(jié)果也包括細(xì)菌自身的進(jìn)化）。抗生素的副作用以及耐藥菌株的存在將嚴(yán)重威脅著人類的健康，而且臨床亞治療水平的抗生素更容易促使抗性基因的轉(zhuǎn)移，比如對動(dòng)物進(jìn)行低水平四環(huán)素治療，其糞腸菌群由對四環(huán)素敏感逐漸變成抗四環(huán)素zui后發(fā)展成對其它藥物也產(chǎn)生抗性。在長期的生活中，恰恰是人類和動(dòng)物腸道的正常菌群成了耐藥基因的儲(chǔ)存庫，并不斷的將耐藥基因轉(zhuǎn)移給致病菌，并在人和動(dòng)物中交叉?zhèn)鞑?，尤其是釋放到環(huán)境中耐藥菌的危害更為嚴(yán)重，可造成耐藥基因的迅速轉(zhuǎn)移。
2.2抗生素的毒副作用
殘留在動(dòng)物性食品中的抗生素被人們食用后，除了加速人體內(nèi)耐藥菌株的進(jìn)化之外，抗生素本身的毒副作用往往威脅人類尤其是孕婦和嬰兒的健康，這一點(diǎn)在過去往往很容易被忽視。
2.2.1氯霉素
主要由Streptomyces venezuelae產(chǎn)生，目前已能人工合成。它能抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)生物合成，其效應(yīng)部位位于核糖體上，因而對大多數(shù)G+菌和G－菌都有殺傷力。氯霉素的毒副作用較多，其常見的是再生障礙貧血、造血功能紊亂、灰嬰綜合征、肢體感覺和運(yùn)動(dòng)障礙及休克。雖然氯霉素在動(dòng)物疾病防治上曾發(fā)揮過一定的作用，但由于氯霉素可以產(chǎn)生致命性的副作用，因此歐盟已經(jīng)在畜牧、水產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)中禁止使用。
2.2.2b－內(nèi)酰胺
b－內(nèi)酰胺類抗生素通過抑制細(xì)菌轉(zhuǎn)肽酶的活性而干擾細(xì)胞壁肽聚糖的合成，安芐青霉素和青霉素G是該類zui常見的兩種化合物，由Penicillium chrysogenum產(chǎn)生。它可以通過胎盤傳給胎兒，也能通過乳腺進(jìn)入乳中。zui常見的副作用是以皮膚出現(xiàn)紅斑為主要癥狀的過敏反應(yīng)以及胃腸道紊亂引起的腹瀉、惡心和嘔吐。
2.2.3四環(huán)素
包括Oxytetracycline （土霉素，OTC）、tetracycline （四環(huán)素，TC）、 chlortetracycline （金霉素，CTC） 和doxycycline （強(qiáng)力霉素，DC）等。
2.2.4 b－興奮劑
為擬交感神經(jīng)類藥物，該類興奮劑的受體為b2受體故得名。該類興奮劑可以促使肌肉骨骼肌血管壁擴(kuò)張、支氣管和子宮平滑肌松弛。因而在獸醫(yī)臨床上b2興奮劑被廣泛用作支氣管擴(kuò)張藥和子宮松弛藥，同時(shí)也被非法用作動(dòng)物營養(yǎng)再分配的促生長劑。副作用，如：焦躁、震顫、過敏、神智不清、食欲不振、惡心和嘔吐等以及心悸、高血壓、心律失常、心動(dòng)過速等心血管癥狀，其中擬交感神經(jīng)類物質(zhì)在組織中的溢出均可導(dǎo)致組織壞死。
2.2.5雌激素
是一種人工合成的非固醇類雌激素，主要用于治療婦科紊亂、乳房和前列腺惡性腫瘤，為一種致癌物質(zhì)；在肝臟中代謝緩慢，zui終能隨尿和糞便排出。副作用包括：水腫、引起性欲沖動(dòng)、改變月經(jīng)周期、乳房異常發(fā)育、肝功能改變、胃腸道紊亂、衰竭、頭痛、皮膚紅斑、風(fēng)疹。對于雄性動(dòng)物來說，大劑量的雌激素可以增加血管栓塞的危險(xiǎn)。此外，雌激素還能引起子宮內(nèi)膜增生，使患子宮癌的頻率增加。大劑量使用雌激素還可以導(dǎo)致骨骼發(fā)育閉合，停止生長。也能促使生殖道變形，對于雄性動(dòng)物能使精子變形以及嘔吐等。
2.2.6氨基甙類抗生素
主要包括慶大霉素、鏈霉素、新霉素、卡那霉素等，為以氨基環(huán)醇和氨基糖相連成核糖單位的多價(jià)陽離子復(fù)合物。氨基甙類通過與細(xì)菌核糖體不可逆結(jié)合而干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜塌陷。氨基甙類藥物的主要副作用是對聽覺器官和腎的毒性、過敏反應(yīng)以及對神經(jīng)肌肉的影響。其中，慶大霉素能引起肝功紊亂、外周和中樞神經(jīng)炎（包括腦炎、呆滯、抽搐）；鏈霉素能導(dǎo)致神經(jīng)紊亂，包括視覺神經(jīng)炎和外周神經(jīng)炎，以及嚴(yán)重的皮炎、過敏等超敏感反應(yīng)。
二、獸藥殘留的快速檢測方法
目前上對抗生素和激素類藥物殘留的檢測主要有儀器分析法（包括HPLC和GC-MS）和生物學(xué)快速檢測法（如：ELISA、RIA、CharmⅡ等）。其中，儀器分析法既要求儀器設(shè)備具有相當(dāng)高的精度，也要求技術(shù)人員具有一定的操作和分析技能。作為儀器分析法，其昂貴的價(jià)格和軟件更新的緩慢以及操作上的煩瑣限制了此法的推廣；但由于檢測的靈敏度可以達(dá)到ng水平，在一些國家大型實(shí)驗(yàn)室里仍作為檢驗(yàn)的參考依據(jù)使用。而生物學(xué)快速檢測法由于其操作上的簡便、快速以及達(dá)到ng水平的靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，以成為動(dòng)物產(chǎn)品中獸藥殘留檢測的一種重要手段。尤其是ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）和CharmⅡ，其操作上的簡便、快速和強(qiáng)烈的信噪比、達(dá)到ng水平的靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，其缺陷在于該法會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，但做為一種快速篩選方法備受技術(shù)人員的青睞，在檢測部門有著廣泛的應(yīng)用前景。
1、ELISA檢測
1.1 所需儀器設(shè)備
酶標(biāo)儀：常用的有美國的bio-lab（百樂），Bio-Tex,芬蘭Labsystem等，價(jià)格在5萬人民幣左右；
氮?dú)獯蹈蓛x：美國 Organomatic Associates，2萬左右；
洗板機(jī)（不一定要配置）：與酶標(biāo)儀相應(yīng)，價(jià)格在3-4萬人民幣左右；
離心機(jī)：6000g/min，國產(chǎn)價(jià)格在5000左右；
均質(zhì)器：德國IKA，人民幣6000左右；（拍式均質(zhì)器：1-2萬）
移液器：單道：1550/件，多道：5000/件；
恒溫培養(yǎng)箱：
固相萃取儀：
1.2常用ELISA試劑盒
英國朗道（RANDOX），德國拜發(fā)（r-Biopharm），德國Riedel-deHaen，荷蘭E-D，美國NEOGEN，意大利Tecna等。
1.3檢測原理（競爭法）
1.3.1 抗原抗體的基本結(jié)構(gòu)
1.3.2檢測的基礎(chǔ)是基于抗原抗體的膠體特性與極性基的吸附作用。抗體的蛋白質(zhì)（免疫球蛋白），大多數(shù)抗原也是蛋白質(zhì)，在水溶液中都具膠體特性，并帶電荷，形成相對穩(wěn)定的親水膠體。同時(shí)抗原、抗體含有羧基、氨基及肽鏈等極性基團(tuán)，當(dāng)兩者由于理化特性相吻合互相吸引而結(jié)合后，成為憎水膠體系統(tǒng)?？乖涂贵w的相互吸引和結(jié)合是依靠下列各種分子間引力所促成：
庫侖吸引力/靜電引力，抗原和抗體分子相反電荷的氨基和羧基之間相互吸引而促成；
范德華引力，由于抗原和抗體分子的外層電子之間相互作用的擾動(dòng)產(chǎn)生一種引力，引起分子吸引而發(fā)生結(jié)合，這種作用取決于分子的空間構(gòu)型；
氫鍵結(jié)合作用，具-OH、-NH2、-COOH等親水基團(tuán)的抗體和相應(yīng)的抗原接近時(shí)，可形成相對微弱和可逆的氫鍵橋梁，使得抗原抗體結(jié)合；
疏水作用，抗原抗體分子側(cè)鏈上的某些氨基酸（如亮氨酸、頡氨酸及苯丙氨酸等）為疏水基團(tuán)，當(dāng)抗原抗體分子表面上的這些疏水基團(tuán)密切接觸時(shí)可排除水分子，在兩者之間產(chǎn)生相互吸引力而發(fā)生結(jié)合。
1.3.3抗原抗體的結(jié)合具有：
特異性：取決于抗原決定簇的數(shù)量、性質(zhì)和立體構(gòu)型；抗體Fab段的高變區(qū)和相應(yīng)抗原決定簇的結(jié)合能力. 所以抗原抗體的種類質(zhì)量直接影響結(jié)果
可逆行: 結(jié)合僅是分子表面的結(jié)合,而非共價(jià)鍵的結(jié)合,具有相對穩(wěn)定性但為可逆反應(yīng).一定條件下（低PH、冬融、高濃度鹽等）所以緩沖液很重要
zui適比例性：兩者量需具一定的量比關(guān)系才發(fā)生zui強(qiáng)的結(jié)合反應(yīng)。所以抗原抗體的數(shù)量也是重要因素
反應(yīng)具階段性：受環(huán)境中電解質(zhì)、溫度、PH、等因素的影響。所以在ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí)各種步驟一定要準(zhǔn)確到位。
1.3.4以氯霉素為例：
酶標(biāo)板包被針對兔IgG（氯霉素抗體）的羊抗體。加入氯霉素抗體，氯霉素酶標(biāo)記物，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液或樣品溶液。游離氯霉素與氯霉素酶標(biāo)記物競爭氯霉素抗體結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)氯霉素抗體也與固定的羊抗體結(jié)合。沒有結(jié)合的氯霉素酶標(biāo)記物在洗滌步驟中被除去。將酶基質(zhì)和發(fā)色劑加到板孔中并孵育。結(jié)合的氯霉素酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物。加終止液后使顏色由藍(lán)變黃。用450nm判讀，吸光度值與樣品中氯霉素含量成反比。 大多數(shù)試劑盒包被的是二抗。
RONDOX的試劑盒是直接將氯霉素特異性抗體預(yù)包被酶標(biāo)板上，當(dāng)在酶標(biāo)孔中加入樣品和酶標(biāo)記氯霉素后，樣品中的氯霉素和酶標(biāo)記氯霉素競爭抗體結(jié)合位點(diǎn)，洗滌后底物顯色，加酸終止之后，顏色由藍(lán)變黃。用450nm判讀，顏色深度與樣品中氯霉素含量成反比。
不同的ELISA原理直接影響其檢測下限、特異性及結(jié)果的計(jì)算。
1.4 樣品的前處理
不同樣品有其特定的前處理方法，主要有以下幾種：
1.4.1有機(jī)物抽提法：（氯霉素）
利用藥物在有機(jī)物中的溶解性，達(dá)到分離純化的目的
樣品均質(zhì) 稱量 乙晴和或乙酸乙酯抽提 離心 吹干
異辛烷/氯仿或正己烷抽提 離心 取水相分析
1.4.2離子交換法（如：C18過柱法）（鏈霉素）
離子交換是利用一些帶離子基團(tuán)的物質(zhì)，吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)按所帶電荷不同或量的差異分成不同的組分。
樣品稱量 溶解 上柱
C18柱平衡 洗柱 吸柱干燥 洗提 吹干
緩沖液重懸 分析
1.4.3（免疫）親和層析（雌激素）
利用生物大分子的生物學(xué)特性而設(shè)計(jì)的層析分離技術(shù)，如利用抗原和抗體、酶和酶的抑制物或配體、激素和受體等之間的親和力，在一定條件下，兩者可緊密結(jié)合形成復(fù)合物，若將其中一者固定在載體上，則可從溶液中提取和分離相應(yīng)的另一方，并達(dá)到很高的純度。現(xiàn)有商品化生產(chǎn)，（方便，減少裝柱等繁瑣步驟）其操作步驟與上者相似，可以按照試劑盒提供的步驟進(jìn)行。
1.5酶標(biāo)免疫分析程序（室溫20-240C條件下操作）
每一個(gè)盒中的試劑足夠進(jìn)行96個(gè)測量（包括標(biāo)準(zhǔn)測定孔），以E-D CAP檢測試劑盒為例：
1）取出試劑盒恢復(fù)至室溫，充分混均；
2）釋緩沖液（以ddw）稀釋備用（也可用磷酸鹽緩沖液，但要）；
3）洗緩沖液（以ddw）稀釋備用，也可用PBST（磷酸鹽土溫—20緩沖液）；
4）酶標(biāo)記物的配制：按試劑盒說明配置、混均，2-8度陰暗處保存；
5）抗體的配制：按試劑盒說明配置、混均，2-8度陰暗處保存；
6）取足夠的微空條，記錄加樣順序；
7）a．吸取100微升稀釋緩沖液A1、A2（試劑空白），
b．吸取50微升稀釋緩沖液到B1、B2（零標(biāo)準(zhǔn)），
c．吸取50微升標(biāo)準(zhǔn)液到C—H孔，
d．加50微升樣品到其余孔；
8）加酶標(biāo)記物和抗體到除A1、A2的所有孔；
10）蓋膜，震蕩1分鐘；
11）在一定條件下孵育；
12）洗板，一定要*充分，并且次數(shù)固定，推薦用洗板機(jī)（百樂）；
13）加底物，室溫培養(yǎng)（25度）孵育；
14）加終止液；
15）450nm波長下讀數(shù)。
1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
a．每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液或樣品的OD值均要減去空白A1、A2的OD值，
b．標(biāo)準(zhǔn)液和樣品的OD值除以零標(biāo)準(zhǔn)（B1、B2）的OD值
c． 繪制半對數(shù)曲線（以B/B0為Y軸，標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度的對數(shù)為X軸），可用一些專業(yè)軟件，也可用半對數(shù)紙或在EXCEL上繪制。
2、CharmⅡ檢測
CHARM II 6600/7600分析儀是一臺(tái)多功能、單樣品的液體閃爍（LSC）和生物發(fā)光計(jì)數(shù)器。該法具有快速、簡便的特點(diǎn)，但其假陽性率教高，適宜快速篩選
2.1儀器組成：
Charm II 6600 / 7600分析儀
Charm孵育器
CentraCL2離心機(jī)
均質(zhì)器、移液器
2.2 檢測原理
微生物受體免疫分析法，屬于免疫分析法的一種，其建立的基礎(chǔ)是藥物功能團(tuán)與微生物受體位點(diǎn)的結(jié)合反應(yīng)。在某些方面類似于放射免疫分析（RIA），所不同的是RIA使用抗體作為結(jié)合劑，而受體分析則是使用細(xì)菌細(xì)胞的固定位點(diǎn)當(dāng)做特殊的結(jié)合劑。
一個(gè)單一的細(xì)菌細(xì)胞含有可結(jié)合藥物的特殊結(jié)合位點(diǎn)，藥物和受體位點(diǎn)的結(jié)合反應(yīng)離解常數(shù)低，因而具特異性和靈敏性。對于該法具體原理Charm公司未有詳細(xì)深入的報(bào)道（商業(yè)方面考慮），主要是利用兩種不同的細(xì)菌提供7大類抗生素結(jié)合的必須位點(diǎn)，藥物的功能團(tuán)與位點(diǎn)有關(guān)，不象免疫分析只涉及到側(cè)鏈，一種微生物受體可結(jié)合一類藥物的所有藥物。
象ELISA類似，這種結(jié)合也是一種競爭結(jié)合。在試管中加入一定量的細(xì)菌（受體）、放射性標(biāo)記藥物和樣品，樣品中的藥物和放射性標(biāo)記藥物競爭結(jié)合受體，未于受體位點(diǎn)結(jié)合的標(biāo)記性藥物在讀數(shù)前被去掉，加入閃爍液，在分析儀上讀數(shù)。
2.3檢測的一般程序
2.3.1準(zhǔn)備工作：首先按說明書配制好所需的提取緩沖液、M2緩沖液、陰性對照和陽性對照。
儀器零點(diǎn)測定：用空試管測定儀器的零點(diǎn)是否正常。
試劑和儀器有效性確認(rèn)：檢測陰性對照液和陽性對照液各3次，求出cpm值的平均值，與出廠的計(jì)數(shù)單對比，能在其±10%左右波動(dòng)。如果與計(jì)數(shù)單相比偏移較大，試劑可能部分失效，但只要陽性平均值/陰性平均值小于0.7，試劑仍然可用，但靈敏度會(huì)有所降低。
控制點(diǎn)的確定：控制點(diǎn)是陰性結(jié)果與陽性結(jié)果的臨界值。利用控制點(diǎn)來判斷結(jié)果。有兩種確定控制點(diǎn)的方法：根據(jù)樣品的種類或檢測水平選擇適當(dāng)?shù)目刂泣c(diǎn)確定方法?？刂泣c(diǎn)確定方法有二。有些說明書上兩種方法都列出，用戶可根據(jù)需要選擇，選第二種。
方法一：直接以陰性對照來確定控制點(diǎn)，一般樣品干擾小或接近儀器的下*，采用這種方法，只需再做3次，與前3次試劑性能確認(rèn)的結(jié)果一起求平均值，然后減法X%，即為控制點(diǎn)。X為變數(shù)，由廠家用定量方法校準(zhǔn)。
方法二：以空白加標(biāo)樣品來確定控制點(diǎn)。這種方法的關(guān)鍵是找到陰性樣品，如果沒有其它的定量方法找陰性樣品，可根據(jù)陰性對照平均值來找陰性樣品（陰性對照平均值±X%）。用此陰性樣品，按檢測水平和稀釋倍數(shù)，加抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，用此空白加標(biāo)樣品，測定6次CPM值，求平均值，控制點(diǎn)＝平均值＊（1＋20%）。
2.3.2測定實(shí)際樣品
前處理：不同的樣品具不同的前處理方法，一般尿樣、血清、血漿等只需用緩沖液稀釋即可，而組織樣品則需均質(zhì)、提取、孵育等過程，對于蜂蜜等一些樣品則要過柱?？偟膩碚f，前處理要比ELISA更簡便、快速。
按照操作說明檢測結(jié)合試劑片加入試管；加入300微升水混均；加入處理過的樣品；加入標(biāo)記性藥物，混合；孵育；離心，棄去上清液；加水混均；加閃爍液，混均；讀數(shù)。
三、實(shí)驗(yàn)室分析質(zhì)量控制
涉及儀器的校正、過程控制、標(biāo)準(zhǔn)物控制、環(huán)境、實(shí)驗(yàn)室管理（監(jiān)控所進(jìn)行的測試及記錄結(jié)果，以便發(fā)現(xiàn)發(fā)展趨勢，統(tǒng)計(jì)技術(shù)進(jìn)行結(jié)果評審）
1、快速篩選方法及定性方法
選擇性：檢出目的物質(zhì)的能力；
靈敏性：樣品中檢出這種藥物真正陽性結(jié)果的比率；
準(zhǔn)確性：所得值和真實(shí)值的一致性，用不確定度來衡量——重復(fù)多次測定值和真實(shí)值之差；
檢測限：分析方法能從樣品背景信號中檢測出待檢物質(zhì)的zui低濃度；
重復(fù)性：
2、定量方法的附加要求
回收率：
定量限：分析方法能對樣品中待檢物質(zhì)進(jìn)行定量檢測的zui低濃度，反映該方法在低濃度端分析結(jié)果的可靠性；
精密度：對同一樣品重復(fù)測定，每次測定值和均值的接近程度，主要反映隨機(jī)誤差；
重復(fù)性：批內(nèi)重復(fù)、批間重復(fù)線形范圍：曲線的擬和
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